томский государственный университет
кафедра органической химии

 

КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Иммунофлуоресцентное исследование

Одна из наиболее простых процедур клинической диагностики. На пленку наносят исследуемый объект (сыворотка крови и т.п.). Образец может содержать, а может и не содержать антигенов возбудителя подозреваемой патологии. Для проверки на ту же пленку наносят раствор антител к искомому антигену, конъюгированных (т.е. связанных ковалентно) с молекулами флуоресцирующего соединения, которое в данном случае выступает в роли маркера, удобного для обнаружения. Пленка выдерживается в растворе антител некоторое время, достаточное для связывания антител с антигенами (если таковые имелись в исследуемом образце), после чего избыток несвязавшихся антител смывается буфером, а пленку рассматривают на флуоресцентном микроскопе. Если в образце присутствовал антиген патологии, с его молекулами будут прочно связаны молекулы меченых флуоресцеином антител и под микроскопом можно наблюдать зеленое окрашивание.

Практически близки к вышеописанному методу иммуногистохимические исследования, отличие заключается лишь в том, что контрольные антитела к выявляемой патологии конъюгированы не с флуоресцентным маркером, а с белком-ферментом. В качестве таковых часто используются пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза. После проведения этапа сорбции антител на возможных молекулах антигена требуется еще прибавление раствора субстрата для протекания ферментативной реакции. Одна единственная молекула белка-фермента способна катализировать превращение десятков и сотен тысяч молекул неокрашенного субстрата с образованием окрашенных продуктов, усиливая таким образом "сигнал" и повышая чувствительность определений. После остановки реакции в местах нахождения антигена появляются цветные окрашенные полосы:


Тесты с ингибированием гемагглютинации эритроцитов не отличаются особой чувствительностью определений, но зато относительно просты в исполнении и нетрудозатратны. Для проведения такого исследования смешивают анализируемый объект с раствором антигена (подозреваемой патологии). Если в испытуемом образце имеются антитела к антигену возбудителя, происходит их комплексообразование, которое в дальнейшем предотвращает агглютинацию (слипание и выпадение в осадок) красных кровяных телец (эритроцитов или RBC), под влиянием молекул антигена. Реакция выполняется на планшетах с лунками с коническим дном, результат (наличие-отсутствие агглютинации) наблюдают непосредственно, т.е. невооруженным глазом. Натренированный человек способен различать даже степени протекания агглютинации. В реакции применяются эритроциты подходящего организма. К сожалению, многие гликопротеины, являющиеся антигенами вообще, способны давать реакцию агглютинаци эритроцитов, поэтому метод не отличается особой специфичностью.


Наиболее надежным анализом на присутствие специфических антител является метод иммуноблоттинга, чаще называемый просто "Western Blot". Он проводится в качестве подтверждения на наличие специфических антител возбудителя в таких случаях, когда положительную реакцию получают методом полимеразной цепной реакции (PCR) и некоторыми другими. Метод трудоемок и может быть исполнен далеко не во всякой клинической лаборатории. Вначале осуществляется разделение антигенов подореваемой патологии (взятых из заведомо инфекционного материала) гель электрофорезом (чаще всего- разделение по молекулярным массам). После этого осуществляется процедура переноса результатов гель-электрофореза на нейлоновый или ацетат-целлюлозный фильтр (собственно, блот). Эта процедура описана отдельно. В результате ее точная картина расположения белковых полос на геле переносится на фильтр, с которым осуществляются все дальнейшие операции. А именно: фильтр обрабатывается анализируемым образцом, и если в нем имеются антитела к возбудителю, они образуют прочный комплексы с молекулами антигенов. Далее избыток образца удаляется, фильтр промывется и обрабатывается раствором конъюгата- антител, против антител к искомому антигену, конъюгированных с молекулами белка-фермента. Для получения конъюгата первоначально получают антитела против антител к антигену, вводя антитела к антигену в организм кролика, который и вырабатывает эти антитела. После их "сшивают" с молекулами белка-фермента подходящей реакцией. Указанные молекулы конъюгата присоединяются только к тем молекулам антител, против которых они были выработаны, соответственно, они "метят" молекулы антигена, разделенные в гель-электрофорезе. Остается смыть избыток конъюгата и провести ферментативную реакцию, в результате которой окрашивается и визуализуется, по крайней мере, часть картины электрофоретического разделения. Анализом этой картины можно получить важные сведения о характере патологии. В качестве белка-фермента применяются, чаще всего, все те же пероксидаза хрена (субстратом для которой является орто-фенилендиамин) или щелочная фосфатаза (субстрат- п-нитрофенилфосфат).



Посмотреть также

Иммуноферментный анализ

Southern Blot, Western Blot, Northern Blot

© khassanov, MMII-MMXV