Многие генетические заболевания у млекопитающих связаны с отсутствием или дефектами внутриклеточных белков, вызванные дефектами генов, кодирующих эти белки. Лечение таких заболеваний возможно с использованием рекомбинантных технологий, с применением специально сконструированных кольцевых ДНК (векторов), содержащих НОРМАЛЬНЫЕ гены, отсутствующие в организме. К настоящему моменту времени созданы многочисленные векторы для этих целей, способные экспрессировать в клетках млекопитающих in vitro. Однако, подобные векторы, применяемые in vivo, должны быть селективны по отношению к тканям с дефектными клетками. Непосредственное генетическое модифицирование в организме насчитывает слишком мало примеров успешного применения.

Определенные типы разработанных векторов позволяют репликацию, транскрипцию и трансляцию чужеродных генов, осуществляемую на клеточных культурах, выращиваемых in vitro, включая ДНК- и РНК- вирусные векторы, содержащие вставки целевой ДНК. Эти вирусные векторы способны инфицировать и реплицировать в клетке-хозяине. Экспериментально сконструированные векторы позволяют экспрессию чужеродных генов только, если содержат существенные элементы ДНК. Обычно эти элементы привносятся непосредственно с вирусной ДНК.

Так называемые челночные векторы, содержат сигналы репликации, необходимые в бактериальных системах и системах млекопитающих, поэтому могут применяться для производства белков в обоих типах клеток. Челночные векторы могут быть клонированы и очищены из бактериальных клеток в больших количествах, а затем перенесены для экспрессии в клетки млекопитающих. Некоторые из них способны внедряться в геном клетки-хозяина, другие- остаются внехромосомальными (эписомальными), сохраняя, однако стабильную возможность экспрессии заложенного в них интересуемого гена, Некоторые из последних- кочуя в дочерние клетки при их делении, другие- работая только в период жизни клетки.

Процесс переноса информации чужеродной ДНК в эукариоту в виде вектора называется трансфекцией. Подобный процесс переноса информации в клетки прокариот называют трансформацией. Наиболее часто используемый метод трансфекции включает образование комплекса ДНК с фосфатом кальция или DEAE-декстраном, которые затем захватываются клеткой в результате эндоцитоза. ДНК затем переносится из цитоплазмы в ядро, где и происходит ее репликация и экспрессия. Детали механизма трансфекции неизвестны. Обычно трансфекции подвергаются 10-20 % клеток культуры.

Популяция эукариотических клеток, подвергшихся трансфекции, должна быть обнаруживаема с целью их направленного выращивания, ведь их относительное число не превышает 10-20 %. Конструирование векторов, содержащих экспрессируемый ген и маркер одновременно, чрезвычайно сложно, поэтому прибегают к котрансфекции, когда в клетку вносят одновременно два вектора, с геном и маркером. В большинстве случаев, не менее 90 % преобразованных клеток содержат оба вектора.

Два из наиболее широко применяемых маркера- гены тимидинкиназы (тк) и дигидрофолат-редуктазы (дгфр). Продукт тк-гена – тимидинкиназа образуется в большинстве клеток млекопитающих и участвует в путях метаболизма тимидина. Некоторые мутантные линии клеток не содержат функционального гена тимидинкиназы (тк-) и такие клетки не выживают в средах, содержащих гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Только те из (тк-)-мутантных клеток, которые в результате котрансфекции получат вектор, несущий нормальный ген, способны к росту. Они и подвергаются процедуре внедрения интересуемого генома.

Ген дегидрофолат-редуктазы (дгфр) необходим для поддержания в клетке нормального уровня активности дегидрофолат-редуктазы, необходимой в биосинтезе нуклеотидов. Клетки, не содержащие этого фермента, выживают только в средах, содержащих тимидин, глицин и пуриновые азотистые основания. Если провести трансфекцию мутантных клеток одновременно двумя векторами (с интересуемым геном и геном дгфр), то становится возможным их определение от нетрансфектированных клеток при выращивании на средах, не содержащих перечисленные выше компоненты.

Другой подход для определения немутировавших клеток- использование для котрансфекции бактериального гена, кодирующего аминогликозид-3’-фосфотрансферазу (АФТ). Клетки, экспрессирующие ген АФТ, устойчивы к аминогликозидным антибиотикам типа неомицина и канамицина, ингибирующих синтез протеинов как у прокариот, так и у эукариот. Поэтому векторы, несущие ген АФТ, могут применяться как на бактериальных клетках, так и на клетках млекопитающих.

“Чужие” гены можно экспрессировать применяя трансформированные вирусом эукариотические клетки. Например, клетки линии COS-1 есть симиановые клетки CV-1, трансформированные ori-дефектным вирусом SV-40. Дефектный вирусный геном внедряется в геном клетки и способен только продуцировать вирусные белки, в то время как сами вирусы не продуцируются, вследствие нарушенной репликативной функции. Однако, если в трансформированную таким образом клетку внести рекомбинантную ДНК вируса SV-40 с ненарушенной репликативной системой, содержащую к тому же вставку из интересуемой ДНК, то начнется репликация рекомбинантных вирусных плазмид в больших количествах. Они, оставаясь внехромосомальными, накапливаются в количествах до 100 тысяч на клетку, одновременно происходит транскрипция интересуемой ДНК-овой вставки с образованием мРНК и синтез целевого белка в результате трансляции. Клетки COS-1 погибают через 3-4 дня, возможно, из-за токсического действия эписомальной векторной ДНК, и целевой белок может быть выделен.

вверх
процессинг нуклеиновых кислот
секвенирование ДНК
рекомбинантные ДНК и биотехнология
нуклеиновые кислоты
вернуться на начальную страницу ORGCHEM.TSU.RU
подробное содержание раздела

© khassanov, MMII-MMXVIII