Методы очистки и выделения белков. Часть 1.

Перед тем, как определять первичную структуру белка, белок очищают от многочисленных примесей, среди которых присутствуют: другие белки, неорганические соединения, низкомолекулярные соединения и т.д. Наиболее опасными примесями в белках являются различные протеазы- ферменты, расщепляющие полипептидную цепь белка. Очистка белков осложняется также большей подверженности чистых белков денатурации. Все вместе взятое усложняет процесс получения чистого белка в количествах, обеспечивающих возможность определения первичной структуры.

Чистота полученного белка (так называемая гомогенность) должна быть подтверждена не менее, чем двумя методами, и еще лучше- иммуноблоттингом, который подтверждает наличие у материала антигенных детерминант, присущих нативному (натуральному, неповрежденному) белку.

Для разделения белков используют такие их физико-химические характеристики, как наличие зарядов, степень гидрофобности, молекулярная масса, наконец, специфические взаимодействия.

Ультрацентрифугирование белков

Выполняется на высокоскоростных (24 000 мин-1и выше) ультрацентрифугах. Предназначенные именно для этой цели называются "ультрацентрифугами Сведберга". Под воздействием центробежных сил происходит движение белковой молекулы в направлении от оси вращения. Чтобы вызвать "седиментацию" относительно мелких белковых молекул, требуется создать довольно значительное цетробежное поле, т.е. скорость вращения ротора центрифуги должна быть достаточно высока. Белки различной массы продвигаются с различными скоростями, наиболее тяжелые движутся быстрее, малые- медленнее. Наблюдать за движением полос белка в процессе центрифугирования позволяет специальная оптическая система (УФ 260 или 280 нм) по поглощению в ультрафиолетовом спектре.

Масса разделяемых молекул выражается в относительных единицах- (единицы Сведберга)- S, которые связаны со скоростью движения протеинов следующим уравнением:

S = V/w²r, где:

w - угловая скорость вращения ротора;

r – расстояние от центра вращения до протеина;

V – скорость движения протеина

S –единицы Сведберга, 1 S = 10^-13 c).

Между единицами седиментации (седиментационными коэффициентами) S и молекулярной массой белка (MW) имеется довольно сложное соответствие:

MW = RTS/D(1-nr), где:

R - универсальная газовая постоянная;

S - седиментационный коэффициент;

D - коэффициент диффузии протеина;

n - специфический объем (удельный) протеина;

r- плотность среды.

Это означает, что для перевода результатов ультрацентрифугирования в значения молекулярной массы требуется установление в другом независимом эксперименте таких параметров, как удельный объем протеина и его коэффициент диффузии в среде центрифугирования, что очень часто является невыполнимым. Поэтому молекулы характеризуют при помощи коэффициентов седиментации S, которые часто называют единицами Сведберга.

Примерное соотношение между седиментационными коэффициентами и молекулярной массой некоторых белков

	S20, x 10-13 (см сек-1 дин-1)	MW (молекулярная масса)
Лизоцим	2,19	15000-16000
Альбумин	4,6	69000
IgG	6,6-7,2	153000
Фибриноген	7,63	340000
a-2-макроглобулин	19,6	820000
IgM	18-20	1000000

Существует разновидность ультрацентрифугирования, когда разделение белков происходит в емкости с градиентом концентрации раствора CsJ. В этом случае плотность раствора (концентрация) CsJ увеличивается в направлении от оси вращения. Когда молекула белка достигает области раствора, плотность которого равна плотности белка, ее движение прекращается. Существуют варианты проточных ультрацентрифуг для препаративного разделения белков в относительно больших количествах.